Guide de l'acheteur Technologie PCR
La technologie de réaction en chaîne par polymérase (PCR) est un élément de base d'innombrables laboratoires de recherche et d'essais, dans une gamme de domaines, notamment la biomédecine, les diagnostics cliniques, les tests de microbiologie alimentaire et la criminalistique criminelle. Cette technologie fondamentale utilise le cycle thermique pour faciliter une série de réactions dans lesquelles un échantillon d'ADN est rapidement répliqué de manière exponentielle pour produire des millions ou des milliards de copies de séquence. Lors de l'acquisition d'un nouveau système PCR, il est important de prendre en compte les objectifs finaux de votre application, la précision et l'efficacité de l'équipement de cyclage thermique ainsi que la capacité et la flexibilité de l'instrument. Cet article donne un aperçu des différentes options et fonctionnalités disponibles pour les systèmes PCR afin de vous aider à trouver un système adapté à votre application.
1. PCR vs qPCR vs dPCR
Alors que tous les systèmes de PCR répliquent l'ADN en utilisant la réaction en chaîne par polymérase, il existe différentes méthodologies utilisées par différents systèmes pour obtenir des résultats spécifiques. Parmi ces différentes méthodes figurent la PCR standard, la PCR quantitative (qPCR) et la PCR numérique (dPCR).
Les machines PCR standard sont généralement utilisées pour amplifier l'ADN pour d'autres tests et utilisations en aval ; en un sens, cette technologie est utilisée comme un moyen de générer un produit final plutôt que comme une méthode de test analytique elle-même. L'ADN amplifié ne peut être mesuré qu'après la réaction de PCR si elle est terminée, plutôt qu'en temps réel, et par conséquent cette méthode est parfois appelée PCR au point final. Le produit final de l'amplification PCR traditionnelle est couramment utilisé pour le clonage et le séquençage en aval, et peut également être vérifié par électrophorèse sur gel pour confirmer la présence de séquences cibles et leur quantité relative à faible résolution (basée sur l'intensité de la bande).
Pour une quantification plus rapide et précise de la quantité de séquence cible présente dans un échantillon, la PCR quantitative (qPCR), également connue sous le nom de PCR en temps réel, utilise des sondes fluorescentes pendant le processus d'amplification pour surveiller la quantité d'ADN présente après chaque cycle thermique. En observant combien de cycles sont nécessaires pour atteindre un certain seuil d'intensité de fluorescence, l'analyste peut déterminer la quantité d'ADN dans le matériau de départ lors de la comparaison des résultats à une courbe standard. La qPCR peut également confirmer la présence ou l'absence d'une séquence cible plus rapidement que la PCR en point final, et est donc utilisée dans des applications de diagnostic telles que la détection du SRAS-CoV-2 (en utilisant la transcription inverse pour convertir d'abord l'ARN viral en ADNc).
La PCR numérique (dPCR) est une autre méthode quantitative dans laquelle les réactions PCR ont lieu dans des milliers de chambres de réaction séparées, et le nombre absolu de molécules d'ADN dans l'échantillon d'origine peut être déterminé en fonction du nombre de chambres de réaction produisant un signal fluorescent une fois l'amplification terminée. . Contrairement à la qPCR, les mesures de fluorescence ne sont pas effectuées en temps réel et une courbe standard n'est pas nécessaire pour quantifier l'ADN dans l'échantillon. Bien que la dPCR ait généralement un débit limité et des coûts plus élevés que la qPCR, elle est plus précise, sensible et précise dans la quantification de l'ADN et est particulièrement utile dans des applications telles que la détection de mutations rares et de polymorphismes mononucléotidiques (SNP).
La détermination du choix de la PCR en point final (qualitative/semi-quantitative) par rapport à une méthode quantitative (qPCR ou dPCR) est relativement simple lorsque vous considérez votre application, mais le choix entre qPCR et dPCR peut être plus nuancé. La qPCR est à haut débit, rentable et suffisamment sensible pour de nombreuses applications, mais la dPCR peut être un meilleur choix si la quantification absolue avec des limites de détection basses est primordiale.
2. L'importance du contrôle de la température
La capacité des thermocycleurs à ajuster et contrôler avec précision et efficacité la température des échantillons est ce qui permet le succès des réactions d'amplification et devrait être au centre de la sélection de tout système PCR. Différents systèmes peuvent offrir différentes capacités en ce qui concerne les taux de rampe, l'uniformité et la précision de la température, et la capacité d'obtenir des gradients de température sur les blocs thermiques pour faciliter l'optimisation de la méthode PCR.
Le taux de rampe fait référence à la vitesse des changements de température entre les étapes de cycle thermique et est généralement exprimé en degrés Celsius par seconde (°C/sec) dans les spécifications de l'instrument. Les fabricants peuvent fournir des informations sur les taux de rampe maximum et les taux de rampe moyens ainsi que faire la différence entre les taux de rampe de montée (chauffage) et les taux de rampe de descente (refroidissement) d'un instrument. En général, des taux de rampe plus élevés correspondent à des durées d'exécution plus rapides, mais les acheteurs doivent se méfier de se concentrer sur des taux de rampe maximum sans examiner d'autres paramètres liés à la vitesse de l'instrument. Un instrument peut n'atteindre son taux de rampe le plus élevé que pendant une courte période de temps, et le taux de rampe moyen reflétera mieux le rythme des changements de température. Bien que les spécifications de vitesse de rampe puissent donner une idée générale de la vitesse à laquelle certains instruments peuvent fonctionner, lorsque cela est possible,
La précision et l'uniformité de la température sont également essentielles pour des réactions réussies et bien que tous les thermocycleurs soient conçus pour produire les températures nécessaires à la PCR, certaines caractéristiques peuvent offrir un degré de confiance plus élevé, ce qui est essentiel pour les applications dans lesquelles les échantillons peuvent être limités et des résultats fiables sont primordiale, comme dans les diagnostics cliniques et la médecine légale. Un contrôle précis de la température est également crucial lors de l'utilisation de la machine PCR pour des techniques sensibles telles que l'analyse de fusion à haute résolution (HRM). Un couvercle chauffant peut assurer une meilleure uniformité de température dans tout le tube PCR, car sans couvercle chauffant, l'échantillon peut s'évaporer et se condenser vers le haut du tube où la température est plus froide. La conception du bloc thermique a également un impact sur le contrôle de la température ; les blocs en aluminium sont l'option la plus économique mais sont les moins conductrices, ce qui signifie qu'ils atteindront l'uniformité de la température plus lentement et auront des taux de rampe inférieurs à ceux des blocs plus conducteurs. Les blocs recouverts d'argent et d'or sont plus chers mais permettent un transfert de chaleur plus rapide, assurant une répartition uniforme de la température dans tout le bloc.
Différentes cibles d'ADN peuvent nécessiter des températures différentes pour obtenir les meilleurs résultats d'amplification ; par exemple, les séquences riches en GC ont besoin de températures plus élevées pour la dénaturation. Les températures de recuit idéales sont également affectées par une série de facteurs - alors que les températures pour cette étape sont généralement sélectionnées en fonction des températures de fusion des amorces, des différences de températures de fusion entre les paires d'amorces et de l'influence de la concentration de réactif, du pH et de la concentration de sel peuvent tous faire de l'optimisation des conditions de température de réaction une tâche compliquée. Les machines PCR avec des capacités de gradient de température sont conçues pour aider à l'optimisation des méthodes PCR en permettant de tester plusieurs températures de recuit en une seule passe. En fonction des types et de la diversité des échantillons que vous envisagez d'analyser à l'aide de votre appareil PCR,
3. Blocs thermiques
Comme mentionné, le bloc thermique utilisé avec un instrument PCR peut faire une différence dans le contrôle de la température, mais la conception du bloc - et la conception de l'instrument pour accueillir différents blocs - a également un impact sur le débit, les coûts des consommables et la flexibilité. Les blocs typiques se présentent sous un format 96 puits ou 384 puits, bien que d'autres formats tels que 48 puits et 1536 puits soient également disponibles. Un nombre de puits plus élevé permet un débit plus élevé avec des volumes de réaction plus faibles, ce qui sera initialement plus coûteux mais réduit finalement le prix par réaction en raison du volume inférieur de réactif utilisé pour chaque puits. Compte tenu du nombre d'échantillons que vous traiterez et de la fréquence d'utilisation de la machine, vous déterminerez si un bloc thermique à nombre de puits inférieur ou supérieur sera le plus pratique et le plus rentable pour votre laboratoire.
Certains instruments sont livrés avec un format de bloc fixe tandis que d'autres permettent d'utiliser des blocs interchangeables, offrant plus de flexibilité pour basculer entre les formats 96 et 384 puits ou entre différents matériaux de bloc pour différentes applications. Certains thermocycleurs accueillent également plusieurs blocs dans le même instrument, ce qui permet d'exécuter différents protocoles sur différents ensembles d'échantillons en même temps.3 Les blocs aux dimensions « universelles » améliorent encore la flexibilité d'utilisation de tubes, de barrettes ou de plaques PCR de tailles différentes selon les besoins. .
En raison du rôle clé de ce composant dans le contrôle de la température, la manipulation des échantillons et le débit, les options de bloc thermique doivent être soigneusement prises en compte lors de la sélection d'un thermocycleur. Pour les laboratoires avec un faible volume d'échantillons, ou ceux qui n'exécutent régulièrement qu'une poignée d'analyses, des instruments à bloc fixe à moindre coût avec un format standard à 96 puits peuvent suffire. Cependant, les instruments modulaires et flexibles peuvent être avantageux pour les laboratoires avec un plus grand nombre de protocoles, des volumes d'échantillons variables et plus d'utilisateurs s'appuyant sur le même instrument pour leurs propres tests, ainsi que pour les laboratoires qui souhaitent étendre leur capacité de débit à l'avenir.